지질 나노입자의 메신저 RNA는 지질로부터 HEK 293 세포를 구출합니다.

Scientific Reports 12권, 기사 번호: 22293(2022) 이 기사 인용

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세포 생리학을 연구하는 분석 도구는 약물-숙주 상호 작용을 최적화하는 데 중요합니다. mRNA 유무에 관계없이 코로나19 백신 유사 지질 나노입자인 LNP로 처리된 HEK 293T 세포에서 대사산물 생산의 동역학을 모니터링하기 위해 실시간 펄스 추적 NMR 분광법인 RTPC-NMR이 도입되었습니다. 동위원소 표지를 대사산물에 통합하고 세포에서 표지된 대사산물을 제거하기 위해 동역학 플럭스 매개변수를 분석했습니다. 알라닌 생산의 특징적인 시간 변화는 세포를 지질 나노입자인 LNP로 처리한 결과 미토콘드리아 기능 장애와 관련이 있습니다. 미토콘드리아 기능 장애는 LNP에 mRNA가 포함되어 LNP의 크기와 균일성이 증가함으로써 크게 완화되었습니다. 이 방법론은 모든 배양된 세포에 적용 가능합니다.

세포 대사에 의해 구동되는 선천적 번역 기계를 활용하는 슈도우리딘 변형 mRNA 지질 나노입자, LNP 기반 코로나19 백신의 놀라운 성공은 이 기술을 의학의 최전선으로 추진하고 있습니다1,2,3,4,5,6 . 당뇨병7,8,9, 암 및 유전 질환10,11과 같은 만성 질환을 치료하기 위한 mRNA LNP의 많은 잠재적 응용이 테스트되었습니다. 메신저 RNA 기반 치료제는 각 응용 분야에 최적화되어야 하는 복잡한 생물학적 분자 세트를 활용합니다. 이 세포가 살아있는 조직에서 부족한 영양분을 얻기 위해 주변 세포를 능가할 수 있습니까? mRNA 유전자 산물의 효과적인 생산은 얼마나 오래 지속되나요? 메틸 슈도우리딘을 방출하는 mRNA LNP의 분해가 전사를 억제합니까? LNP를 구성하는 지질이 혈장과 내부 세포막을 손상시키나요? 이러한 문제는 매우 중요하며 치료 시행을 촉진하기 위해 해결되어야 합니다.

약물 치료에 대한 세포의 동적 반응은 일반적으로 질량 분광학 또는 NMR 분광학12,13을 사용하여 수행되는 대사 프로파일링을 통해 평가할 수 있습니다. 이 방법론은 일반적으로 총 대사산물 농도를 검출하기 위해 세포 용해 및 추출이 필요하며, 샘플을 준비하는 데 필요한 다단계 프로세스로 인해 본질적으로 편향된 몇 시간에서 며칠 동안 세포 생리학의 스냅샷을 제공합니다12,13. 침습적 방법은 대사 네트워크의 구획 구조를 파괴하고 LNP 기반 백신 섭취 후 발생하는 반응 과정을 반영하지 못할 수 있습니다. 실시간 NMR 분광학은 자연 13C 존재비 또는 추적자 기반 분석을 사용하여 세포에서 13C 동위원소 편집된 1H 스펙트럼을 수집하여 대사산물을 식별하므로 신속한 데이터 수집이 가능하므로 실험의 시간적 분해능이 10분 이하로 증가합니다14,15.

보다 최근의 실시간 NMR 기반 대사체학 연구는 생물반응기를 사용하여 세포를 생리학적 활성 상태로 유지하고 유리 세포 내 대사산물을 검출할 수 있지만 몇 분 동안 발생하는 해당과정과 같은 주요 반응을 모니터링하는 능력이 부족합니다16,17,18 . 실시간 펄스 추적 NMR 분광법인 RTPC-NMR의 도입은 13C-포도당 및 13C 편집 양성자 NMR의 사용과 초고감도 NMR 저온 프로브19 및 향상된 생물반응기20 설계를 결합하여 실험의 시간 분해능을 47초로 높입니다. 자극에 반응하여 대사 플럭스의 급격한 변화를 허용합니다. 13C 표지된 대사산물은 표지되지 않은 배경에서 관찰됩니다. 이 방법은 자극이 대사 경로에 어떻게 영향을 미치는지 밝히기 위해 편견 없이 13C 탄소 통합의 역학을 포착하여 세포 건강을 분석하는 최첨단 기술을 나타냅니다.

우리딘 대신 N1-메틸슈도우리딘을 함유하는 변형된 루시퍼라제 mRNA는 이전에 발표된 프로토콜 기반으로 시험관 내 전사에 의해 제조되었으며 모든 실험에 사용되었습니다. N1-메틸슈도우리딘을 통합하면 mRNA 안정성이 증가하고 포유류 세포에서 단백질 발현이 향상됩니다22,23. 정제된 전사체에는 단백질 번역을 더욱 촉진하기 위해 ~ 150개 뉴클레오티드 3' 폴리(A) 꼬리와 5' Cap124가 포함되었습니다(보충 그림 1). 변형된 mRNA를 5개의 형질감염 시약을 사용하여 24시간 동안 HEK 293T 세포에 형질감염시켰다(그림 1a, 보충 표 1). HEK 293T 세포는 이전에 루시퍼라제 mRNA의 흡수 및 발현을 모니터링하는 데 활용되었습니다. Kariko et al.21,22에 따르면 단 하나의 시약인 Lipofectamine 2000, LF만이 루시퍼라제 의존성 발광 신호를 생성하기에 충분한 mRNA를 세포에 전달했습니다.

24 h, consistent with a high energy charge and metabolically active cells33. HEK 293T cells were packaged as previously described into small, ~ 0.6 mm diameter, alginate beads by using an atomizer20 and modified Krebs–Henseleit, KH, buffer34, a classical chemically defined35 serum-free medium used to study cardiomyocytes. KH buffer salts were supplemented with glucose, bovine serum albumin, BSA, insulin, and palmitic acid. The critical feature of the bioreactor is a microporous irrigation stem (Fig. 3a) that permits uniform distribution of the fresh medium across packed cell beads33 in 5 mm NMR tube and facilitates quick exchange of the medium from the ~ 200 µL NMR sampling volume. A 15 mL pulse of uniformly labeled [U, 13C]-glucose was administered through an injection loop attached in line with the medium delivery tubing and controlled by a mechanical switch (Fig. 3a). To avoid the formation of air bubbles, the inner diameter of the tubing was matched with the orifices of the joints throughout the device. Flow was controlled by a peristaltic pump to deliver 100–200 uL/min. The performance of the device was optimized to introduce a pulse of labeled glucose with a rise time, ~ 10 min, that is faster than the characteristic time of glycolysis, 10–20 min36. To that end the experimental temperature was adjusted to 300 K to slow cellular metabolism37. The optimization runs showed that 10 million cells packaged into alginate beads and fed by using a microporous irrigation stem are able to consume ~ 25% of the 13C-glucose administered over the course of the experiment (Supplementary Figure 2)./p>